Для получения клоновой культуры используют накопительную культуру, полученную при проращивании одной цисты[1].
На стерильное предметное стекло наносят каплю накопительной культуры, содержащей подвижные клетки. На второе стерильное предметное стекло наносят не менее трех капель стерильной среды f/2. Из капли с накопительной культурой микрокапилляром отлавливают одиночную подвижную клетку и переносят ее на предметное стекло в каплю среды. Затем клетку переносят в следующую каплю; этот процесс повторяют не менее трех раз, каждый раз меняя стерильный микрокапилляр. Отмытую изолированную клетку при помощи стерильного микрокапилляра помещают в отдельную пробирку, содержащую 5 мл среды f/2.
Для успешного получения клоновой культуры необходимо изолировать не менее 25 клеток. По окончании этой процедуры пробирки закрывают стерильными колпачками и помещают в климатостат с температурой 15°С, освещенностью 3500 лк и свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота. Через 3 сут и далее ежедневно проводят мониторинг выделенных клеток под микроскопом: просматривают содержимое каждой пробирки и информацию вносят в журнал с указанием даты наблюдения.
После увеличения количества подвижных клеток (до плотности не менее 1000 клеток/мл) 1 мл культуры переносят в колбы Эрленмейера или
[1]Покоящаяся циста динофлагеллят образуется в результате полового размножения и является диплоидной (то есть несет двойной набор хромосом, 2N). Для получения клоновой культуры (то есть культуры клеток, генетически идентичных исходному материалу) необходимо получить культуру из одной гаплоидной (вегетативной) клетки.
пластиковые флаконы для культивирования с объемом питательной среды 50 мл (рисунок).
Рисунок. После увеличения количества подвижных клеток динофлагеллят их переносят из пробирок в пластиковые флаконы и/или колбы Эрленмейера.
Пластиковые флаконы и/или колбы Эрленмейера помещают в климатостат (рисунок) с температурой 15°С, освещенностью 3500 лк и свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота.
Рисунок. Климатостат, содержащий клоновые культуры динофлагеллят рода Alexandrium.
Численность культуры на стадии экспоненциального роста должна быть не менее 1×104 клеток/мл. Для поддержания экспоненциального роста клоновых культур динофлагеллят рода Alexandrium пересев на свежеприготовленную среду f/2 осуществляется регулярно один раз в 7 сут.
Порядок действий и последовательность пересевов описаны в разделе Поддержание культур.