Полученную после обработки на ультразвуковой установке суспензию осадка промывают фильтрованной морской водой объемом не менее 500 мл через капроновые фильтры «Nitex». Сначала используют фильтр с диаметром пор 80 мкм, затем - фильтр с диаметром пор 20 мкм с целью получения тонкой фракции осадков (размер частиц 20–80 мкм), содержащей цисты динофлагеллят (рисунок).
Рисунок. Подготовка пробы морских осадков к промывке через капроновые фильтры «Nitex».
Количество цист динофитовых микроводорослей учитывают под микроскопом в камере «Седвик-Рафтер» (Sedgewick-Rafter Counting Cells) объемом 1 мл. Для получения культуры динофлагеллят одиночные цисты отлавливают микрокапилляром под микроскопом. На стерильное предметное стекло наносят каплю стерильной морской воды и в нее переносят изолированную цисту (рисунок).
Рисунок. Цисту отмывают под инвертированным микроскопом в нескольких каплях стерильной морской воды.
Процесс повторяют не менее трех раз, каждый раз меняя стерильный микрокапилляр. Таким образом отмывают цисту от сопутствующих водорослей и бактерий.
Отмытую цисту при помощи микрокапилляра помещают в отдельную лунку 96-луночного планшета для культивирования, содержащую 200 мкл среды f/2 (рисунок).
Внимание: одну цисту помещают в одну лунку планшета для культивирования.
Рисунок. Изолированную цисту переносят в отдельную лунку планшета для культивирования.
Для успешного получения накопительной культуры необходимо изолировать не менее 50 цист. По окончании этой процедуры планшет для культивирования необходимо заклеить по периметру изоляционной лентой, чтобы избежать испарения питательной среды из лунок, содержащих цисты (рисунок).
Рисунок. Планшет для культивирования, заклеенный по периметру изоляционной лентой.
Планшеты помещают в климатостат с температурой 15°С, освещенностью 3500 лк и свето-темновым периодом 12 ч свет/12 ч темнота.
Ежедневно проводят мониторинг изолированных цист под микроскопом: просматривают содержимое каждой лунки и при обнаружении проросшей цисты (этот факт устанавливается по наличию на стенке цисты открытого архиопиля) информацию вносят в журнал с указанием даты. Как правило, прорастание цист отмечается через 2–3 сут после изолирования.